摘要：试验旨在研究牛支原体(Mycoplasma bovis,M.bovis)武威株二氢硫辛酰胺转乙酰酶(PDHc-E2)基因序列特征及其在牛支原体细胞中的位置。参照GenBank中牛支原体HB0801株pdhc基因(登录号:CP002058.1)设计引物,应用PCR扩增获得牛支原体武威株pdhc基因,在测序及序列分析的基础上,应用Overlap PCR完成点突变后将其克隆至pET-28a(+)中,构建原核表达载体pET-pdhc。pET-pdhc转化大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞后经IPTG诱导获得融合蛋白,将纯化蛋白免疫新西兰兔制备多抗血清,应用iELISA和Western blotting对牛支原体武威株PDHc-E2在细胞内的分布进行初步研究。结果显示,牛支原体武威株pdhc基因CDS全长735 bp,编码244个氨基酸,与国内牛支原体分离株HB0801、Hubei-1、CQ-W70、NM2012等基因序列完全一致,与国际标准株PG45同源性为99.2%,与无乳支原体(M.agalactiae)同源性为90.9%~91.2%,与加利福尼亚支原体(M.californicum)ST6株的同源性仅为78.4%,基因序列非常保守;通过Overlap PCR将该基因中4个编码色氨酸的TGA密码子突变为TGG,且完成点突变后的基因在大肠杆菌中成功表达,重组蛋白大小约为29 ku,主要以可溶性形式存在,iELISA结果显示,重组蛋白PDHc-E2具有较高的免疫原性,可刺激新西兰兔产生高水平的抗体,血清效价高达1∶100 000;亚细胞定位结果表明,制备的多抗血清与重组蛋白PDHc-E2、牛支原体全菌蛋白、牛支原体膜蛋白、牛支原体胞浆蛋白均能发生特异性结合,说明该蛋白在牛支原体细胞膜和细胞质中均有分布,为膜相关蛋白,但在细胞质中的分布多于细胞膜。本研究结果为进一步研究牛支原体的生物学功能提供了理论依据。
分类：期刊> 自然科学与工程技术> 医药卫生科技> 感染性疾病及传染病
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关键词：牛支原体 二氢硫辛酰胺转乙酰酶 原核表达 亚细胞定位
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